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随着二代DNA测序在临床上的应用，再生障碍性贫血的诊断评估和危险分层也在迅速发展。早期识别高危克隆演变的患者可提示医疗监测和早期干预，从而改善预后。
早在50年前，血液学家就注意到再生障碍性贫血（AA）与其他克隆性造血疾病相关，引发著名的“Dameshek之谜”。此后，X染色体灭活式样分析以及细胞遗传学研究相继揭示AA骨髓偏颇造血和经常出现染色体核型异常，证明其克隆性造血特征。与其他原发恶性血液肿瘤克隆性造血发生机制并不完全相同，AA骨髓造血干祖细胞池极度萎缩和免疫发病机制的病理生理背景在其克隆造血的发生、发展中同样发挥重要作用，赋予AA克隆性造血独特特性。现代分子遗传学技术，尤其二代基因测序技术的应用，使多种低变异位点频率的克隆也得以辨识，正确解读在AA患者检出的这些突变克隆造血非常重要。
AA克隆性造血是一普遍现象
基因突变源自复制错误或DNA损伤修复异常，机体在各种内部和外部DNA损伤因素作用下，随着生命过程的延长，体细胞基因突变将不可避免并逐渐积累。造血干祖细胞和其他组织干细胞一样，随着活存时间延长和增殖分裂次数增多，细胞突变也逐渐发生和积累。有研究表明平均每个造血干细胞每10年发生（1.3±0.2）次外显子突变。采用X染色体灭活式样分析检测6例女性AA患者，4例（67%）外周血粒细胞呈单克隆造血模式；骨髓造血细胞染色体检查，则约15%患者存在细胞遗传学异常克隆；流式细胞术检测细胞膜锚蛋白或锚联蛋白，半数AA患者存在PIGA基因突变所致的PNH克隆细胞。最近，全外显子和靶向基因测序等更为敏感的检测技术应用于AA患者，克隆性造血检出率更是高达47%~72%。若将细胞遗传学、单核苷酸多态性基因芯片，以及全外显子/二代基因靶向测序等结果综合，则从儿童AA的60%到成人患者的近乎%，绝大多数（70%~85%）AA患者可检测到克隆造血。
克隆性造血类型提示可能的发生机制
体细胞基因突变大多并不改变相关蛋白质的合成和结构，因而为无害突变；某些突变则引致细胞多样性，并使造血干细胞及其子细胞适应环境压力。然而，若基因突变使造血干细胞自我更新分裂加快，或凋亡减缓，则可导致造血干细胞过多复制形成更大克隆以及外周血细胞的不平衡。AA患者最常见的细胞遗传学异常包括-7/7q-和+8染色体异常，另外常见者尚有13q-，+6，+15和+21，其他类型异常则较为少见。约13%AA患者单核苷酸芯片基因型检测具有6号染色体短臂MHC位点部位拷贝数中性杂合性缺失（6pCN-LOH），而该位点缺失在普通人群极少发生。分子遗传学克隆性造血异常类型也主要集中在PIG-A，BCOR/BCORL1，ASXL1和DNMT3A基因异常。
这些在AA患者出现的高度偏倚的克隆造血类型，提示其发生同样是以骨髓免疫异常微环境为背景，遵循达尔文暟适应-选择暠的结果。反之，依据某些异常造血克隆类型也可推测其可能的筛选压力。PIGA突变造血克隆就是最好的例证。现有资料无证据表明PNH造血干细胞具有内源性生存优势，其克隆扩增更主要得益于外部因素即免疫攻击的作用。由于AA异常免疫攻击的靶抗原可能为锚联蛋白，因而PNH造血干细胞丢失GPI锚和锚联蛋白则逃逸了免疫攻击。6pCN-LOH影响HLA栺类分子，尤其HLA-A*02;01，A*02;06，A*03;01和B*40;02表达，导致自身抗原不能有效递呈。造血干祖细胞缺失细胞*T淋巴细胞攻击靶抗原，逃逸免疫攻击从而获得相较正常造血干祖细胞的生长和克隆扩增优势。因此，当AA患者出现PNH克隆和6pCN-LOH克隆则可推测存在造血免疫攻击压力，判断该骨髓造血衰竭免疫发病机制更为可靠。
AA患者克隆性造血是以年龄相关克隆性造血类型为基础，先期存在的年龄相关突变再经细胞*T淋巴细胞免疫攻击造血微环境筛选，加之造血干祖细胞功能减退、耗竭，或二者兼而有之，竞争减少，获得某些突变者可能更易扩张，最终形成疫原性丢失或减少和耐受细胞*T淋巴细胞介导凋亡与细胞因子介导的造血抑制，具有逃逸免疫攻击和相对生长优势的造血克隆。与成年和老年患者比较，儿童和年轻成人较少发生骨髓增生异常综合征（MDS）相关的体细胞突变支持这种考虑。
依据分子遗传学克隆造血不能除外AA诊断
早已证明在正常人群，随着年龄增加其骨髓偏颇造血发生的概率也随之增加。应用单核苷酸多态性芯片法检测，在2个大样本研究中发现，50岁以下人群外周血染色体重排的发生率椉0.5%，而在老年人这一概率明显上升至2%~3%。在无任何血液学异常表现的正常人或其他疾病患者全外显子测序结果同样表明，随着年龄增加外周血体细胞突变发生的概率逐渐增高，年龄＞65岁老年人发生克隆性造血近10%。尽管血液学表现正常而具有克隆性造血特征者发生血液恶性肿瘤的机会较未有克隆造血表现者增高约10倍，但就高克隆性造血发生率而言，每年仅0.5%~1.0%进展为MDS/AML，转化率非常低，并且有研究表明克隆造血维持长达10年而不发生恶性血液病转化。由此提出潜力未定的克隆性造血概念，其临床意义与意义未定单克隆免疫球蛋白血症和单克隆B淋巴细胞增多相同。
AA在疾病诊断之初1%~4%（0~23%）即可检测到克隆性染色体异常，随着免疫抑制治疗骨髓造血恢复，这些异常克隆可持续存在或完全消失。除伴有-7/7q-染色体异常的AA对免疫抑制治疗反应不佳、容易发生MDS进展、预后不良较为明确外，出现其他染色体异常克隆的意义并不十分明了，甚至某些常见的克隆性染色体异常，如+8、13q-等，不仅未有恶劣预后，相反常伴有更高的免疫抑制治疗血液学反应率和更好的预后，当伴有PNH克隆时其预后优势更为明显。因此目前认为，除了斪HO认定的MDS特异的染色体改变外，在其他表现均较为典型的AA患者，甚至细胞遗传学克隆造血的存在也不应成为否定AA转而诊断为MDS的依据。
对癌前病变进行基因检测研究肿瘤发生动力学结果表明，肿瘤的发生符合多步骤发病模型，即一系列事件、突变或其他损害，驱动异常克隆逐渐增大，并进展至较先前更为异常的表型。迄今，尚不能确定肿瘤的发生需要多少驱动突变。尽管二代基因测序揭示AA患者MDS/AML样基因异常克隆性造血高发生率，但AA突变克隆通常较小，相对更稳定，多数患者并不一定进展为MDS/AML，即使在最终进展为MDS/AML者也常可克隆大小及造血保持较长时期的稳定。与细胞遗传学改变相似，不应单凭出现分子遗传学克隆造血而除外AA诊断。
分子遗传学异常类型与AA预后
应用靶向基因测序检测患者MDS/AML样基因突变，不同研究组间识别的AA复发性体细胞突变类型基本一致，集中在少数基因类型，包括PIGA，BCOR/BCORL1，ASXL1和DNMT3A，其他类型突变均较少见。研究报道，只要AA患者获得MDS相关基因突变，其MDS转化的风险就明显增高，病史超过6个月疾病进展转化为MDS的概率高达40%。鉴于AA高MDS/AML相关基因突变发生率，短时间如此高的MDS转化率与我们及研究报道的AA晚期克隆性血液学异常发生率差别巨大。在18例儿童和4例成人发病AA共22例患者中，检出PIGA突变7例，此为最多见突变类型；检出2例MDS样基因突变克隆性造血，至报道时均未疾病转化。而最近研究报道发现伴或不伴获得性体细胞MDS/AML样基因突变，对患者免疫抑制治疗血液学反应、总生存和无进展生存均无影响；然而，分别分析不同类型基因突变与预后关系时则发现，获得BCOR和BCORL1突变者免疫抑制治疗血液学反应率更高，该2种类型突变与PIGA突变共同构成“良好突变”，不仅血液学反应率，生存率和无进展生存率也较高。
获得ASXL1，DNMT3A，TP53，RUNX1，JAK2，JAK3和CSMD1突变者，血液学反应率、总生存率和无进展生存率均较低，为“不良突变”。上述不同类型突变与AA预后的关系提示，逃逸T细胞免疫攻击保护性机制筛选突变为“良好突变”，而与年龄相关或促进自我更新和减低分化相关者多为“不良突变”。随着AA病程的延长，前者倾向于克隆稳定或逐渐减小，后者则倾向于克隆逐渐增大。尽管基于对多步骤肿瘤发病机制的认识，获得“不良突变”克隆造血的AA患者可能已经行进在通往MDS/AML的道路上，但肿瘤发生通常至少需要2~8次驱动突变，加之AA克隆造血动力学非常复杂、变异极大。因而在特定患者，分子遗传学异常的检出并不意味着一定发生MDS/AML转化，其预后预测能力有限。
免疫抑制治疗与克隆性血液学异常
AA发生晚期克隆性血液学异常主要涉及免疫抑制治疗患者，接受造血干细胞移植治疗者很少发生。我们认为这很可能与免疫抑制治疗是由残存的造血干祖细胞恢复自身造血，而干细胞移植是重建正常造血，二者造血干祖细胞池构成不同有关。研究发现AA病史长、复发难治者更易发生疾病转化，而不同方案免疫抑制治疗者这一并发症的发生并无明显不同。AA患者即使获得血液学反应，残存造血干细胞也还持续受到以维持外周血细胞正常的造血压力，细胞端粒缩短，遗传不稳定性增加，与先期即已存在的获得性体细胞突变叠合，赋予患者更高的MDS/AML转化倾向。免疫抑制治疗获得血液学反应可能只是赋予患者更长的生存时间，使造血干祖细胞内源性遗传不稳定得以体现。
来源：临床血液学杂志，作者：张凤奎
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